2020/5/22 下午7:08:56
刘震
2020/02/15
Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification Assay for the Detection of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus
题目：逆转录重组酶聚合酶扩增法检测中东呼吸综合征冠状病毒
目的：利用RT-RPA技术快速检测MERS-CoV病毒，同常规RT-PCR相比在灵敏度相当的情况下具有快速、便捷的优点。
方法：RPA技术是一种等温扩增技术，其基本原理是：由重组酶打开双链，引物与模板结合，在聚合酶作用下延伸，期间单链结合蛋白与新生链结合阻止复性，因此新生链可立即进入下一轮扩增。RPA体系中加入逆转录酶可以实现一步法RT-RPA扩增。
结果：检测MERS-CoV病毒时，RT-RPA在42℃ 10min即可完成反应；RT-PCR和RT-RPA检测限均可达到10拷贝（在有些病毒上RT-RPA的检测限要比RT-PCR低一个数量级）。
总结：RPA能够在常温条件下实现核酸的指数扩增，RT-RPA同RT-PCR相比能够有效缩短检测时间，所需设备更加简易便携，在RNA病毒检测领域具有较大应用潜力。
另，如将扩增产物进行生物素等化学标记，可以做成肉眼识别的核酸检测试纸。
原文链接：https://www.ncbi.xilesou.top/pmc/articles/PMC3871419/

2020/02/16
Deep-sea vent phage DNA polymerase specifically initiates DNA synthesis in the absence of primers
题目：深海火山口噬菌体DNA聚合酶能够在无引物条件下启动DNA合成
目的：NrS-1 DNA聚合酶能够在无引物情况下直接从dTNPs或NTPs上延伸DNA链，颠覆了依赖引发酶的DNA合成的教条性认识。
方法：构建pET28b表达载体，转化大肠BL21（DE3），诱导表达后经Ni柱和Superdex 200柱分离纯化，得到纯酶，在无引物条件下进行ssDNA延伸。
结果：1. NrS-1聚合能力较低，保真性差，NrS-1不依赖引物但需要ssDNA模板；
2. NrS-1能够从dNTP和NTP上起始DNA合成，当dNTP和NTP同时存在时，NrS-1偏好dNTP；
3. NrS-1的最佳反应温度为50°C，产物的长度从几百个核苷酸到约2,000个核苷酸，聚合反应需要Mg2 +，最佳浓度在5至10 mM之间；
4. NrS-1从头合成效率在不同DNA模板上的巨大差异，完全互补的DNA的两条链的扩增效率可能相差若干倍，必须有特定的起始序列；
5. NrS-1结构上与古细菌引发酶具有弱同源性，N端截短结构仍有从头合成能力，但活性低于全酶，N端负责聚合，C端负责DNA结合；
6. NrS-1在解旋酶或ssDNA结合蛋白的协调下，能够增强延伸能力，但随着NrS-1浓度增加延伸长度逐渐减小。
        NrS-1 DNA聚合酶介导的DNA合成抛弃了对引发酶的依赖，拓宽了人们对DNA复制方式的认识，但NrS-1还有很多缺陷，要在实际生产中应用还有很多路要走。如果能够通过定向进化把NrS-1改造成一个优秀的聚合酶，并导入人体替代人聚合酶的话，就能够解决端粒缩短的问题，长生不死或许可能实现。
原文链接：https://www.pnas.org/content/114/12/E2310.full

2020/02/17
Simple rolling circle amplification colorimetric assay based on pH for target
DNA detection
题目：基于pH值的简单滚环扩增比色法检测目标DNA
目的：将pH敏感的显色剂与DNA扩增反应偶联，DNA合成过程中不断释放H+，pH的变化使得显色剂发生染色变化，从而直观的判断扩增产物。该方法可应用于核酸即时检测，具有POCT应用潜力。
方法：本文以H5N1流感病毒为对象，选取苯酚红作为显色剂，以Bst作为等温扩增酶，首先合成锁式引物，锁式引物与模板配对，经过连接和扩增反应，显色剂随着pH变化发生颜色转变。
结果 ：1. pH比色法高度依赖pH，反应体系中均无Tris缓冲液，经过比较8.2是最合适的初始pH；
2. 经过反应条件优化，75nM是最佳引物浓度，63°C 20min即可观察到显著的颜色变化，但63°C 1h可能出现假阳性结果；
3. 通过标准曲线，pH比色法对H5N1的检测限为0.61nM；
4. 将156 nM和2.4 nM的H5N1掺入到鼠血中模拟真实样本，未稀释血浆中的复杂组分会影响样本OD和浊度，但仍能够观察到较显著的颜色变化。
    pH比色法的关键是反应初始给一个高pH环境，随着聚合反应的进行，pH逐渐降低，苯酚红颜色逐渐减淡，从而判断产物的扩增情况。反应的难点在于，锁式引物的连接和随后的聚合都是在无Tris缓冲液的环境中进行的，对酶的效率和方法的稳健型是一个挑战。核酸检测是POCT一个重要的分支，pH比色法提供了一种快速、便捷、可视的方法，具有较大前景。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0039914019303923

2020/02/19
题目：通过CSR定向进化技术改善Taq功能
Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication
目的：CSR技术通过油水混合，形成一个个微小的油包水体系，每个体系就好像一个独立的隔离室，含有携带Taq表达载体的大肠杆菌、dNTP、PCR buffer和引物，油包水体系在高温条件下仍具有极高的稳定性，通过PCR循环，大肠杆菌释放出Taq DNA聚合酶，具有高活性的聚合酶以自身基因为模板进行PCR扩增，反应结束，通过分析被富集的DNA产物即可得到突变基因。该方法具有十分高效的筛选效率，在耐热型DNA聚合酶的分子中具有重要应用。
方法：将Taq DNA polymerase表达载体转入大肠杆菌，诱导表达后，将菌与PCR组分混入油水体系，按筛选压力处理后（长时间加热/增加肝素浓度），进行热循环扩增，提纯DNA，使用通用引物扩增，重新克隆至大肠杆菌。可以将得到的突变体，重新混组进行下一轮CSR，得到的突变克隆子进行表达纯化后与野生酶比较。
结果：1. 得到一个热稳定性显著改善的突变体，T8（F73S, R205K, K219E, M236T, E434D, A608V），在97.5°C下的半衰期提高11倍，从1.5min提高到16.5min，但T8的催化效率有轻微的下降，同时扩增保真性也有所下降；
2. 得到一个肝素耐受性显著提高的突变体，H15（K225E, E388V, K540R, D578G, N583S, M747R），在高浓度肝素抑制剂下活性提高130倍以上，但H15的耐热性显著下降，催化活性也有轻微下降；
3. 热稳定性突变主要集中在Taq酶的N端5‘-3’外切酶结构域 ，已有报道指出：截断Taq的5‘-3’外切酶结构域 （?280Taq）能提高耐热型，这表明5‘-3’外切酶结构域耐热型可能不如聚合酶结构域，拉了Taq酶的后腿，但?280Taq的DNA持续合成能力降低，本文还发现部分位于5‘-3’外切酶结构域的突变降低了DNA持续合成能力，因此推断对5‘-3’外切酶结构域进行突变可能提高酶的扩增能力；
4. 研究中还发现dNTP可以在油水体系之间扩散，文章指出这种小分子的扩散能够提供“进料室”或“进料器”的作用，具有应用潜力。
    文中得到的两个突变体都是以牺牲酶的催化效率为代价的，这是酶分子改造的常见缺陷，某一优秀性能的获得往往是以失去其它优点为代价的。CSR为耐热型聚合酶定向筛选提供了极大的便利，利用CSR提高酶的热稳定性，改变聚合酶底物谱，增强聚合酶抑制剂抗性，甚至开发聚合酶新功能，都取得了令人瞩目的成绩。但也因为CSR的这种高效性，很容易获得催化性能显著改善的突变体，但正因为这种高效性，容易牺牲聚合酶的保真性，一般，DNA聚合酶的扩增能力与保真性存在对立关系，CSR是难以控制酶的保真性的。这一点还需要新的创意来弥补。
原文链接：https://www.pnas.org/content/98/8/4552.full

2020/02/20
题目：聚合酶的分子进化用于扩增古代DNA
Molecular breeding of polymerases for amplification of ancient DNA
目的：古代样品中DNA经过长期的破环，可能发生了结构上的扭曲，碱基对丢失等不利情况。通过CSR技术进化出适合扩增古代DNA的聚合酶变体，有助于古生物遗传研究。
方法：选择Taq、Tth、Tfl三种聚合酶，经StEP混组突变体库，通过三轮CSR筛选得到若干突变体。设计一重、二重、四重3‘端错配的引物，使用突变体混合酶与Taq野生酶，分别扩增47,000-60,000年前的洞熊DNA，比较扩增效率。
结果：1. 获得若干突变体，其中3A10（Tth-Taq嵌合体并包含L33P，E76K，D145G，P552S，E775G，M777T）和3D1（Tth-Taq嵌合体并包含E76K，E91Q，D145G，R336Q， A448T，I616M，V739M和E744G）性能比较优秀。使用4重错配引物时，Taq无任何扩增产物，3A10和3D1均可，但大多数反应产物比预期的要短。3A10和3D1都能够有效绕过与古代DNA有关的DNA损伤，例如无碱基位点，5-羟基乙内酰脲（5Hyd）和5-甲基-5-羟基乙内酰脲（5MeHyd）。
2. 选择最有希望的突变体，作为Blend Mix（3A10、3B5、3B6 ，3B8、3B10、3C12和3D1），同野生Taq对比，在扩增损伤性DNA时Blend酶的活性是Taq酶的几十倍，但以3A10和3D1为例，他们的保真性分别降低7倍和2-4倍，Blend酶扩增古代洞熊DNA的产量比Taq低2-5倍。使用正常DNA进行归一化比较时发现，Blend酶需要更高的模板量 ，表明个突变体的催化效率实际是下降的，只是“容忍”模板出错的能力提高了，实际上是改变了底物谱。
3. 所选突变体之间有一些一致性的突变（如L33P, E76K, D145G）集中在5‘-3’外切结构域，并且该区域主要来源于Tth，有研究表明Tth5‘-3’外切酶结构域比Taq对应的结构更具热稳定性。研究还发现，5‘-3’外切酶结构域的突变在很大程度上导致错配延伸，表明该结构域可能以未知方式参与错配3‘末端的处理。
    文中所的突变体主要改变了酶对模板错误的容忍能力，在催化效率、保真性、检测限等方面均有下降，所得Blend聚合酶应用范围比较狭窄，在实际应用中的意义不是太大，但为该领域的深入研究奠定了基础。值得注意的是，本文结果表明5‘-3’外切结构域对错配延伸功能具有重要的作用。
原文链接：https://xs.scihub.ltd/https://doi.org/10.1038/nbt1321

2020/02/21
题目：抗PCR抑制剂的Taq DNA聚合酶突变体可从全血和粗土样品中扩增DNA
Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples
目的：全血对Taq具有明显的抑制作用，土壤中的腐植酸等对PCR也具有抑制作用，较高浓度的核酸染料，如SYBR green I、EB等，本文通过定点突变，获得了一个大片段突变体Klentaq 10和一个全长突变体Taq 22，具有显著提高的全血抑制抗性、土壤抑制剂抗性、高浓度荧光染料抗性。
方法：根据之前的研究，626、706、707和708处的氨基酸突变，可以增加酶的“热启动”功能，本文在此基础上进行饱和扫描突变，在大肠中表达、纯化，在抑制剂存在下进行PCR/qPCR扩增，筛选优良突变体，表征并进行抗抑制活性研究。
结果：1. 血液抑制试验发现，Taq被0.1–1％的血液抑制，而Klentaq1（N端278aa缺失大片段）可以耐受5–10％的血液。
2. 研究发现，E708残基对改善Klentaq1全血抗性具有重要作用，经筛选得到突变体Klentaq 10（E626K， I707L，E708K），在5-20%血液抑制实验中，该突变体比Taq，Klentaq1，Tth、rTth、Tfl、Tli（这些酶据报道有较高的血液耐受性）都有更强的耐受性。此外，将Klentaq 10的突变转移到野生型Taq上后，所得突变体的的血液抗性也增强了，但E708K并不是Taq的最优选择。
3. 全长突变体Taq 22（E626K， I707L，E708Q）比商品化的Fast Start Taq和AmpliTaq Gold都有更强的血液抗性。
4. 在（SYBR）qPCR实验中，普通Taq在0.5-1×SYBR中即受到抑制，而Taq 22和Klentaq 10可分别承受2×和4×，与其他荧光染料（如EvaGreen，Syto9，Pico，Toto，Yoyo，LC Green，EB）一起测试时，获得了相似的结果。
5. 在土壤抑制剂实验中，Taq 22和Klentaq 10也都比商品Taq具有显著增强的扩增能力。
6. 将全血与土壤中的抑制剂独立出来，测试Taq 22和Klentaq 10的抗性，结果两个突变体全部都比野生Taq具有更强的抵抗性。
    Taq聚合酶的E708可能对活性中心的稳定性具有重要作用，本文在冷敏感突变体（E626K， I707L）基础上，获得两个抑制剂耐受突变体，为全血核酸检测，“热启动”qPCR等试剂盒开发提供了参考。
原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/37/5/e40/2409751

题目：聚合酶的分子进化获得对环境抑制剂的抗性
Molecular breeding of polymerases for resistance to environmental inhibitors
目的：抑制剂限制了PCR在多种标本中的使用，本文利用Thermus属的八个不同聚合酶为亲本，通过StEP重组和CSR筛选，获得对多种环境抑制剂具有较高抗性的突变体。
方法：以Tfi, Tbr, Tos, Tsc,Tth, Tfl, Taq,  Dei(Deinococcus radiodurans)八个物种的聚合酶为亲本，通过StEP技术获得8T嵌合体文库，转化大肠杆菌，以泥炭提取物、焦油、腐植酸等抑制剂为筛选压力，通过三轮CSR，得到优秀突变体，通过Hi-Prep Heparin FF柱提纯突变体酶进行扩增性能研究。
结果：1. 所的突变体均为嵌合体酶，不同突变体对不同抑制剂有不同抵抗能力，同野生Taq相比，P4F12（F92L, P114Q, K508R）和P6F3（V14A, T27A, E90Q, A184T, K220M, A271V, S739G）对泥炭提取物的抗性提高了4倍和8倍，对纯腐植酸的抗性提高2倍，S5（P114Q, I138V, G371A, V443A, M648V, F694L, F726L）对土壤抑制剂的抗性提高5倍。
2. 选择骨粉抑制剂时，得到一个性能显著优于其它突变体的2D9，经进一步测试，它在所有抑制剂上均有不错的表现，单泥炭提取物来说2D9抗性能力弱于P6F3，此外2D9对全血无任何改善的抗性。研究还发现，2D9抗性与退火温度无关，但与延伸时间有关，在焦油实验上，2D9在较短的延伸时间（15 s对1分钟）显示更大的抗性（与Taq相比）。
3. 使用LacZ法测试保真度时，2D9与Taq相当；以低拷贝数靶标PCR测试2D9和Taq时，2D9的阳性率为70/96，Taq为56/96，并且2D9产生的阳性条带更清晰明亮。
4. 2D9包括至少四种不同的聚合酶的区段。
    文章指出CSR继承性的选择聚合酶保真性，这是其自身的特征，因为这种“自我复制”必须在“错误阈值”内进行。应该是这个意思：如果CSR筛选到的聚合酶保真性显著下降，那么在CSR过程中就会引入随机突变，而这种随机突变可能改变原来的性质，比如降低了对筛选的压力的抗性，那么CSR就会无法进行下去，即“突变者，死”，因此CSR在聚合酶保真性上具有内在稳定性。这种解释我不太认同，有一定道理但不能保证CSR的保真性，1）除非保真性发生数量级程度的下降，一般程度的下降，可能对于普通长度和难度的模板，并不会产生大量随机突变；2）即使发生稳定遗传的随机突变也可能不会显著影响针对筛选压力的性能。
原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/39/8/e51/2411818

2020/02/22
题目：能够读取RNA的热稳定DNA聚合酶的结构和功能
Structure and Function of an RNA-Reading Thermostable DNA Polymerase
目的：先前的研究中得到了两个突变体：M1（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G）和M747K，都具有一定的逆转录酶活性或扩展的底物谱。利用DNA改组技术将这两个突变体混组，筛选出具有较高逆转录活性的突变体，再获得RNA-酶复合物的晶体结构，有助于理解DNA聚合酶是如何区分DNA与RNA模板的。
方法：利用DNA shuffling将M1与M747K混组，挑选1570个克隆子，在96孔板中表达、裂解和热变性，先以DNA为模板筛选阳性，再以RNA为模板筛选阳性。其中，两个突变体（RT-KTq1和RT-KTq2）表现优秀，分离纯化后用于逆转录扩增。
结果：1. 混组得到两个突变体：RT-KTq1（S515R，I638F，M747K），RT-KTq2（L459M，S515R，I638F，M747K），组合突变体：KTqM1 / M747K（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，M747K，E773G）。
2. 在引物延伸验中，KlenTaq无延伸产物，M747K延伸3bp，M1延伸7bp，RT-KTq1、RT-KTq2、KTqM1 / M747K延伸10bp（全长）。RT-KTq2、KTqM1 / M747K不单RNA模板扩增活性显著提高（>100倍），DNA模板扩增活性也有提高（2倍），其中RT-KTq2催化活性最高。
3. RT-KTq2与KlenTaq的(Ca)RMSD仅为0.33埃，将RT-KTq2/RNA与RT-KTq2/DNA进行拟合后发现，由于杂交双链体的几何形状发生了变化，拇指域发生了较大变化，RT-KTq2/RNA处于半开状态，且拇指域与RNA/DNA杂合体的相互作用数量较少了。
4. 在RT-PCR实验中，RT-KTq2表现优秀。扩增MS2病毒RNA时，RT-KTq2比M1早10个循环形成产物，甚至可以有效扩增510bp的片段；扩增人b-actin时，在1 pg-100 ng的宽浓度范围内都具有良好线性；使用TaqMan检测人流感病毒时，在七个不同的标本中均观察到了荧光信号。
    RT-KTq2不仅有较高的逆转录活性，DNA聚合活性也有所提高，而且具有良好的热稳定性，在分子生物学或临床诊断中表现出了较大的应用潜力。RT-KTq2的高耐热性，有利于提高RT-PCR的特异性，RT-KTq2无RNase H活性，天然降低了RNA损伤，兼具双活性，真正实现了逆转-扩增一体化，但论文没有与商品化MMLV逆转录酶对比，如果通过进一步进化能够达到或接近MMLV的逆转录活性，那么RT-KTq2能够成为一款十分优秀的RT-PCR/RT-qPCR工具酶。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/anie.201306655

2020/02/23
题目：在快速PCR循环下进行CSR获得增加DNA结合亲和力和血液抵抗力的Taq DNA聚合酶突变体
Compartmentalized self-replication under fast PCR cycling conditions yields Taq DNA polymerase mutants with increased DNA-binding affinity and blood resistance
目的：Taq作为PCR的“主力军”，延伸速率约60 nt/s，要获得足够量的扩增子，仍然需要耗费更过时间。Sso7d虽然可以显著改善Pfu的延伸速率，但Sso7d与Taq融合并不稳定，本文通过CSR进化出更快的Taq突变体，同时增加Taq的全血抑制抗性。虽然之前有报道通过氨基酸突变改善Taq的血抑抗性，但仅在20%以内的范围内有效，相比之下，CSR拥有巨大优势，所得突变体可以在65%的全血浓度下进行PCR扩增。
方法：构建随机突变体库，转大肠XL10-Gold细胞，从平板上刮下大约250,000个单克隆，制备油水体系，在5轮CSR筛选过程中，延伸时间从2.5min逐渐降至15s，得到的突变体库复转大肠后，96孔深孔板表达，热处理+吸附纯化后，直接用于549 bp的GAPDH靶标qPCR扩增，对比各突变体与野生酶的Ct值。筛选出的突变体经过SP、Q、Heparin柱精纯后，进行qPCR、引物延伸、延伸速率、DNA亲和力、抑制剂抗性测试。
结果：1. 通过突变组合最终得到了最有潜力的4个突变体：Taq 42（G59W，L245M，L375V，E507K，K508R，E734G，F749I），Taq 3B（V155I、L245M、E507K，F749I），Taq 2C2（G59W，V155I，L245M，L375V，E507K，E734G，F749I），Taq 1C2（G59W，V155I，L245M，E507K，F749I），其中Taq 42和Taq 2C2相对更加优秀。
2. qPCR实验中，使用SYBR 方法时，缩短延伸时间（60s-10s），突变体扩增性能要优于野生酶；使用TaqMan方法时，突变体与野生酶几乎无差异。
3. 对突变体的氨基酸进行单独分析，发现E507K是造成快速循环表型的唯一原因。
4. 在放射性标记的引物延伸分析中，与野生型Taq（50nt/s）相比，Taq E507K和Taq 42的聚合速率稍高（85nt/s），但合成能力没有变化（20nt）。
5. 动力学研究显示，Taq 42的Kcat是Taq的2.2倍，Taq 42、1C2和E507K的解离常数（分别为2.75、1.9和1.1 nM）比Taq和Taq G59W（102和91 nM），大约低35-90倍。
6. E507K提高了Taq在95°C下的半衰期.
7. Taq 42、Taq 2C2、Taq 1C2显著改善了Taq对全血抑制的抗性，对EDTA血耐受分别为60%、65%、60%（Taq<1%)，对肝素血耐受分别为10%、25%、30%（Taq
<1%），对NaC耐受为100mM（Taq为25mM）。
    Taq 2C2和Taq 42突变体具有应用在快速qPCR试剂盒中的潜力，本文虽然未给出2C2的详细动力学参数，但在Holly Hogrefe等的专利中列出了2C2的详细特征。本文所得突变体中E507K对提高Taq延伸速率和抑制剂抗性具有至关重要的作用，如果将该突变与其他研究中的突变进行组合或者混合，或许会有更好的结果。
原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2014.00408/full

2020/02/28
题目：一种新型蛋白质工程策略可提高DNA聚合酶合成性能
A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro
目的：来自Sulfolobus solfataricus的Sso7d双链DNA结合蛋白，与Taq和Pfu融合后，能够显著改善聚合酶的合成能力，而且不影响原聚合酶的催化活性与热稳定性。
方法：构建Sso7d N端或C端融合蛋白（S-Taq(?289)、S-Taq、Pfu-S），AMS沉淀+肝素+Ni柱纯化融合蛋白，然后将融合蛋白与野生酶（Taq(?289)、Taq、Pfu）进行引物延伸试验、持续合成活性试验、稳态动力学试验、热稳定性试验和PCR效率测试。
结果：1. 删除Taq N端289个残基后，聚合酶持续合成能力显著降低。
2. Taq(?289)平均引物延伸长度为3nt，S-Taq(?289)为51nt，Taq为22nt，S-Taq为104nt，Pfu为6nt，Pfu-S为55nt。
3. 融合蛋白基本不改变原酶的催化活性，Taq类融合蛋白与野生酶的Kcat基本一致，但Km比野生酶降低4-8倍（Sso7d增加了融合酶结合DNA的能力）；Pfu-S的Kcat是Pfu的1.7倍，Km因过小无法测量。
4. 融合蛋白基本不改变原酶的热稳定性，Taq(?289)在97.5°C的半衰期为39min（Lawyer(1993)早年研究中Taq(?289)为21min，Taq为9min，数据差异较大），S-Taq(?289)为35min，Pfu为730min，Pfu-S为789min。
5. 在进行长片段扩增时，S-Taq与S-Taq(?289)相当（5kb/2min）>野生Taq（2kb/2min）>Taq(?289)，野生Pfu 2min内可以延伸5kb lanmdaDNA片段，而Pfu-S 2min内可以延伸15kb的超长片段，并且使用更低浓度的聚合酶（1/8）。
6. 融合蛋白增加了聚合酶对KCl的耐受性，Taq(?289) KCl耐受性为10mM（可能Taq(?289)的低合成能力限制了PCR扩增），S-Taq(?289)可以承受120mM KCl，Taq KCl耐受性为60mM，S-Taq提高到120mM，Pfu KCl耐受性为30mM，Pfu-S耐受性为120mM。
    融合Sso7d结构域极大提高了Taq(?289)和Pfu的长片段扩增能力，其中对Pfu的效果更为显著，这可能有两个原因：一、Sso7d与dsDNA的亲和力虽然比Taq弱得多，但降低聚合酶与DNA完全解离的可能性，防止DNA过早脱落；二、超长延伸长度可能还与校正活性有关，从平均引物延伸长度的结果看S-Taq(?289)应该与Pfu-S达到相近的产物长度，S-Taq应该更优秀，实际上正好相反，这可能是因为随着延伸的进行，S-Taq/S-Taq(?289)因缺乏校正活性会不断参入错误碱基，这限制了它们的进一步延伸，而Pfu可以将错误碱基切除继续延伸。
    Wang等的研究意义巨大，他们介绍了一种新的思路，通过将一个耐热的、能够与dsDNA结合的结构域同聚合酶融合，结果即不影响原聚合酶的催化活性、热稳定性和保真性（Pfu），又显著提高了酶的持续合成能力和PCR效率。定向进化的方法在改善酶的某一特性时，往往会导致酶的其它特征发生不利变化，而结构域融合的方法完全不同，它倾向于给原酶一种新的功能，可能几乎没有副作用（当然蛋白质融合也是有极大风险的，甚至可能导致酶的全面失活）。更令人振奋的是，Wang等认为这种能够增加DNA结合能力的结构域融合，可能具有广泛适用性，也许还可以用于加强其它核酸酶（连接酶、核酸外切酶等）。
    作者还指出Sso7d对DNA的亲和力较弱可能是有益的，使用更高亲和力的dsDNA结合蛋白可能对聚合酶的催化活性有害，使用更低亲和力的dsDNA结合蛋白可能不会显着提高聚合酶的合成能力，需要进一步的研究来确定dsDNA结合蛋白的亲和力的最佳范围，以实现合成性和催化性之间的最终平衡。
原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/32/3/1197/2904545









2021/10/14 上午9:44:30


2022/2/23 下午9:29:49
hushewei 
2.23
2022/2/23 下午9:29:49
hushewei 

2022/8/22 17:01:58
fdsfasf
saffdssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssfd
2022/10/28 00:49:25
Eamon
test 20201028
2022/12/8 下午3:33:09
sanger
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