原理

将突变碱基设置在引物靠近5'端1/3处，使用引物2和5扩增载体框架，引物1和4、3和6分别扩增含有17-25bp同源区的突变片段，基于同源重组一次性连入所有片段。一般这种方法受制于同源重组效率，不适合超过5个突变位点，如果突变位点大于5个，建议分次构建或者用重叠延伸PCR获得突变基因后连入载体。